空间转录组测序 概述

在多细胞生物中，单个细胞的基因表达严格按特定的时间和空间顺序发生，即基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性可以通过对不同时间点的样本取材，使用单细胞转录组测序技术来解析时间维度上细胞类型和基因表达模式。空间特异性信息则相对较难获得。常规转录组测序和单细胞转录组测序都难以还原细胞所处的原始位置信息。传统的原位杂交技术又很难实现高通量检测。

10X genomic Visium 空间基因表达解决方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）可以测量完整组织切片的总mRNA，将总mRNA的空间信息与形态学内容相结合，并绘制所有基因表达发生的位置，获得疾病复杂而完整的基因表达图谱。在确定不同细胞群的同时保留空间位置，为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。

 

 

 

 

10X genomic Visium 空间转录组技术原理如下：

一张 LP 玻片上对应的4个捕获区域可以构建4个空间文库，单个
捕获区域大小为6.5 mm × 6.5 mm，约5,000个 spot，单个 spot 直径为55 μm, spot 与 spot 中心之间的距离为100 μm，每个 spot 含有独一无二的空间位置条形码（spatial barcode）来标记空间位置信息，且连接着 UMI 和 poly（dT）来捕获靶区域内的 RNA，实现反转录，扩增，和建库测序一系列步骤。

 

 

空间转录组研究的的必要性
研究单细胞想要探究细胞间的异质性，但是常规的单细胞是将细胞解离成单细胞悬液，然后利用单细胞分离技术（微孔，微板，液滴）等方法实现单细胞建库，这里最大的问题是是细胞失去了原本在组织的空间信息。然而这个空间信息在实际研究中有很重要。特别是在研究细胞命运机制及细胞谱系发生空间位置的信息显得尤为重要，因此发展空间转录组技术实现细胞的位置信息的保留，对研究此类细胞状态尤为必要。

  

当前的技术主要有四种策略：
1、基于组学实验结合空间重建的计算策略

 

 这种计算方法可以充分利用内在基因表达模式或共表达的趋势，从单个细胞的大量转录组数据中重构细胞间的环境。然而，这些推论方法在某些情况下仅呈现空间趋势或特定组织的总体布局。

2、激光切割与NGS测序结合的策略

 基于LCM的转录组学或基因组学成功地获得了单个细胞的空间转录组，尽管其通量很低，但是在可以标记成千上万个单个细胞位置的多路复用条形码策略可行之前，将少量细胞的数据粗略地整合到构成器官的巨大背景中，可能具有一定价值。

 

3、基于荧光物质原位的转录组学

 

 基于图像的原位转录组学在很大程度上增加了可检测区域，但也存在一些问题，例如几种smFISH方法很难从包括信号干扰、转录本积累等复杂背景中提取单个细胞。

 

4、基于寡核苷酸的空间条码加上NGS测序

 

 费用较高且无法在单个细胞中获得转录组。

 

空间组学可以应用的方向

1、可以鉴定到疾病的空间位置异质性
对于阿尔茨海默症的研究可以探索到小神经质细胞趋向于阿尔茨海默神经班，通过这个信息可以辅助开发激活小神经质细胞相关药物用来辅助治疗该病症。肿瘤的研究也可以及时了解肿瘤细胞的转移，特别对于浸润性肿瘤的研究。

2、建立空间转录组图谱
构建个人空间转录组图谱将极大提升科研人员对生物体器官间组织间的细胞差异。

3、描述胚胎发育及空间蓝图
胚胎发育的动态过程是科研人员一直为之着迷的，空间组学发展可以清晰的描绘胚胎发育的蓝图。

 

  

2、空间转录组技术原理是什么？

当组织冷冻切片附在空间转录组载片上时，条形码引物结合并从组织中捕获邻近的mRNA。被捕获的mRNA开始逆转录，得到的cDNA中包含了空间条形码。分析Illumina测序结果中空间条形码的序列，可以将每个mRNA转录的序列映射回组织切片中的起始位置。

 

 3、为什么要做空间转录组？

下图A和B是两个肿瘤组织的切片，A样本中存在淋巴细胞浸润现象，预后效果良好；而B样本淋巴细胞都被肿瘤组织阻碍在肿瘤的边缘，预后效果差。

如果只是通过常规转录组或者单细胞转录组，研究人员在两个样本中均可以发现淋巴细胞相关基因或者淋巴细胞群，无法解释两个样本预后之间的差异。但是通过空间转录组，就能很清晰看到两个样本之间的差异。

 

 

4、有哪些技术手段可以进行空间转录组研究？

已发表的关于空间转录组技术有Slide-seq , LCM-seq , seqFISH, MERFISH , Liver single cell zonation , Geo-seq and Tomo-seq。这些方法或是在细胞数量上限制较大，或是存在有效测序深度不足等问题。

10x Genomics公司提供的Visium空间基因表达解决方案是目前唯一一个高通量空间转录组的商业化解决方案。该解决方案可以轻松地将空间转录组学技术应用到组织切片和染色的标准方法中，从而研究空间分辨率下整个转录组mRNA的表达情况，同时在同一组织切片中获得组织学相关信息。

 

5、10x Genomics空间转录组的实现原理是什么？

10x Genomics空间转录组用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域，每个捕获区域的大小为6.5x6.5mm，包含5000个被条形码标记的点（barcoded spots），每个点的直径为55 μm，点和点之间中心的距离为100 μm，并且每个点都有一个唯一的barcode序列。

组织切片的细胞中会释放出mRNA，迁移到每个spot的mRNA会被标记上相应的barcode序列，然后进行文库构建并进行测序。

最后，根据数据的条形码信息对数据进行分析，以确定哪些数据来自哪个位置，从而实现空间基因表达的可视化。

 

 

 

6、10x Genomics空间转录组技术的准确性高吗？

下图是一个将10x Genomics空间转录组技术应用于小鼠海马体研究的案例。A图为脑组织切片的HE染色结果，从10x Genomics空间转录组分析结果中，可以清晰看到Tmsb4x（B图）和Selenow（C图）在海马体区域高表达，和已知的研究结果一致性较高。

 

 

 

7、10x Genomics空间转录组的应用方向有哪些？

10x Genomics空间转录组技术可以应用于肿瘤、免疫、发育、神经和病理等研究方向。

 

 

 

8、10x Genomics空间转录组技术适用于哪些组织样本？

除了皮肤、胰腺和骨头组织外，其余样本类型均可开展10x Genomics空间转录组研究。

10x Genomics公司已经测试完毕的组织类型有：

人：心脏、肾脏、卵巢、乳房、淋巴结、大脑、大肠、肺、脾脏

小鼠：大脑、眼睛、心脏、肾脏、大肠、肝脏、肺、卵巢、四头肌、小肠、脾脏、胃、睾丸、甲状腺、舌头

大鼠：大脑、肾脏、心脏

 

 

文献参考：
https://www.cell.com/trends/biotechnology/fulltext/S0167-7799(20)30140-2

https://www.jianshu.com/p/be5d3ed0257d

https://www.sohu.com/a/369792095_464200

https://www.jianshu.com/p/be5d3ed0257d

https://www.novogene.com/tech/service/Visium/product/

https://zhuanlan.zhihu.com/p/103163429

http://www.novelbio.com/blog/c1/51.html

https://www.jianshu.com/p/a7b0b7f3494e